카바릴-고성능액체크로마토그래피

3.1     고성능액체크로마토그래프
3.1.1고성능액체크로마토그래프는 아래 그림과 같이 이동상보관부, 용매전달부, 시료
주입기, 분리관 및 검출부로 구성되고 검출부에서 나온 신호는 기록부에서 측정목적에
따라 여러 가지 형식으로 보고한다.
               그림 1. 고성능액체크로마토그래프의 구조
3.1.2컬럼은 안지름 3 mm ～ 5 mm, 길이 15 cm ～ 25 cm의 스테인리스 강관에 옥타
데실실릴기(ODS)를 화학결합시킨 실리카겔(입경 5 μm ～ 10 μm)을 충전한 것 또는 이
와 동등의 분리능을 갖는 것 (Novapak C18, Beckman Ultrasphere ODS, Supelco LC-1
등)을 택하여 시험한다.
3.1.3   이동상은 다음과 같다.
3.1.3.1자외선검출기를 사용할 때에는 아세토니트릴 : 정제수(10 : 90)의 혼합비로
시작하여 30분 안에 아세토니트릴(100 %)로 선형 구배하여 사용하고 유속은 1.0
mL/min으로 사용한다.
3.1.3.2형광검출기를 사용할 때에는 메탄올 : 정제수(80 : 20)의 혼합비로 사용하고
유속은 1.0 mL/min으로 사용한다.
3.1.4   자외선 검출기
자외선 검출기 (UV detector)는 220 nm에서 검출할 수 있는 것으로 사용한다.
3.1.5   형광 검출기
형광 검출기의 들뜸파장은 230 nm로 방출파장은 418 nm를 택하여 사용한다.
3.1.6   포스트 분리관 반응기
3.1.6.1이동상에 반응시약을 혼합할 수 있는 장치로서 반응시약을 0.1 mL/min ～ 1.0
mL/min의 유속으로 주입할 수 있는 펌프가 설치된 것을 사용한다.
3.1.6.2   포스트분리관 반응기에서 가수분해는 95 ℃에서 1.0 mL 반응코일에 수산화
나트륨용액(0.05 M)을 유속 0.5 mL/min으로 주입하고 유도체를 위해 실온에서 1.0 mL
반응코일에 OPA 반응용액을 유속 0.5 mL/min으로 주입한다.
3.1.7   여과지
이동상 또는 반응시약용은 47 mm 여과지를 사용하고, 시료는 직경 13 mm 여과지
(직경 0.2 μm 폴리에스터)를 사용한다.
[주 1] 여과지는 Millipore의 HA type(수용액) 또는 FA type(용매)을 사용하거나 동등
이상의 것을 사용한다.
3.1.8   고성능액체크로마토그래프의 조건은 표 2 또는 표 3과 같이 수행할 수 있다.
표 3. 카바릴의 액체크로마토그래피 실험조건 (예)(형광 검출기용)
항 목                     조 건
컬럼          Novapak C18 300 x 4.0 mm, 10 μm
이동상              메탄올 : 정제수 (80 : 20)
유속                    1.0 mL/min
파장          들뜸파장 230 nm; 방출파장 418 nm
주입구 부피                      500 μL
컬럼 온도                       상온

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표 2. 카바릴의 액체크로마토그래피 실험조건 (예)(자외선 검출기용)
항 목                            조 건
컬럼     Novapak C18(300 x 4.0 mm, 10 μm) 또는 이와 동등한 컬럼
이동상              초기 : 아세토니트릴 : 정제수(10 : 90)
30분 후 : 아세토니트릴(100)
유속                           1.0 mL/min
파장                             220 nm
주입구 부피                             10 μL
컬럼 온도                             40 ℃

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