지질 결합 ASO 혈장 SPE - Clarity OTX Pro 10 mg/well
(증발 단계 없는 추출 · 5~2500 ng/mL 회수율 74~110%)
TN-1434 · Phenomenex Technical Note
30초 요약
왜 지질 결합체가 어려운가
원문 서론: 콜레스테롤·장쇄 지방산 같은 지질 결합이 분석 대상을 복잡하게 만들고, 투여량이 낮아 ng/mL 수준의 감도가 필요합니다
증발 단계 없는 추출
Proteinase K 소화 → Clarity OTX Pro 10 mg/well, 혈장 20 µL 상당을 로딩해 50 µL × 2로 용출
5~2500 ng/mL, 회수율 74~110%
검량선 R² 0.9987 · 5~20 ng/mL 회수율은 75~87%로 낮은 편(원문 Table 1, n = 3)
🛋️ The Interpreter: 기술 용어 쉽게 풀기
🧬 이 노트의 분석 대상
5′ 말단에 원문이 "Pal"로 표기한 지질이 붙은 16-mer ASO입니다. 양 끝 3개씩은 2′-MOE 수식, 가운데 10개는 DNA이고, 결합 대부분이 포스포로티오에이트(PS)입니다(서열 표기에서 컬럼피아가 센 구성). 내부 표준(IS)은 11번 G 하나가 빠진 같은 서열입니다. 원문은 "Pal"의 정식 명칭을 따로 풀어 쓰지 않았습니다.
🧲 Clarity OTX Pro는 무엇을 하나
올리고뉴클레오타이드용 SPE 전처리 키트입니다. 원문은 Pro가 개선된 Lysis·Elution Buffer 조성을 바탕으로 지질 결합 ASO를 증발 단계 없이 분석하게 한다고 적었습니다. LC 분리는 별도의 분석 컬럼(Biozen Oligo)이 맡으며, 흡착제의 화학 구조는 이 원문에 수록되지 않았습니다.
조건 요약
| 항목 | 원문 조건 |
|---|---|
| 시료·표준 | 랫드(Sprague-Dawley) 혈장(Innovative Research Inc.) · 지질 결합 ASO LC-MS 표준품(Waters 구입) · IS(TriLink Technologies 구입) |
| Proteinase K 소화 | 혈장 1000 µL + 6 M 구아니딘 HCl 200 µL + 0.5 M TCEP 100 µL + Proteinase K(20 mg/mL) 500 µL · 3000 RPM 1분 볼텍스 · 55 °C 60분 |
| 전처리 시료 | 소화 혈장 500 µL + Lysis Loading Buffer 500 µL |
| SPE (Clarity OTX Pro 10 mg/well) | 메탄올 500 µL → Equilibration Buffer 500 µL → 시료 70 µL(혈장 20 µL 상당) → Equilibration Buffer 400 µL → Wash Buffer 400 µL → Elution Buffer 50 µL × 2 |
| 분석 컬럼 | Biozen Oligo 1.7 µm, 50 × 2.1 mm (00B-4791-AN) · 70 °C |
| 이동상 | A: 물 + 1% HFIP + 0.10% DIPEA · B: 아세토니트릴/물/이소프로판올(60:20:20 v/v) + 0.75% HFIP + 0.35% DIPEA |
| 그래디언트·유속 | 5% B(0~4분) → 95% B(4.1~7분) → 5% B(7.1~15분) · 500 µL/min · 주입 5 µL |
| 기기·검출 | Agilent 1290 · SCIEX 7600 ZenoTOF(원문 표기 "Sciex") · 음이온 · 정량 MRM: 분석 대상 Q1 671.2231 → 134.0465 / 328.0247, IS Q1 712.1222 → 134.0465 / 328.0240 (DP −100 V, CE −25 V) |
※ 용출액의 후처리(희석·재용해 여부)와 IS 첨가 농도, Clarity OTX Pro 각 버퍼의 조성은 원문에 별도 수록되지 않았습니다. MS 소스 조건 전체(가스·온도·Zeno trap 등)는 원문 표에 있습니다.
결과 요약 (원문 Table 1, n = 3)
| 첨가 농도 (ng/mL) | 측정 농도 (ng/mL) | 표준편차 | CV (%) | 회수율 (%) |
|---|---|---|---|---|
| 5 | 4 | 0.02 | 7.75% | 86.95% |
| 10 | 8 | 0.03 | 9.50% | 75.60% |
| 20 | 17 | 0.01 | 3.44% | 84.92% |
| 35 | 26 | 0.07 | 14.09% | 74.02% |
| 75 | 62 | 0.12 | 14.03% | 83.13% |
| 150 | 156 | 0.09 | 5.32% | 103.96% |
| 315 | 346 | 0.09 | 2.68% | 109.75% |
| 625 | 584 | 0.73 | 12.74% | 93.43% |
| 1250 | 1365 | 1.03 | 7.93% | 109.18% |
| 2500 | 2449 | 3.64 | 15.72% | 97.94% |
※ 제조사(Phenomenex) 기술노트의 값이며 컬럼피아가 재현한 값이 아닙니다. 검량선은 y = 2.5506x + 0.0293, R² = 0.9987(Figure 2)입니다.
Figure 1. Full scan spectrum of lipid conjugated oligonucleotide (A). Representative chromatogram with multiple transitions (B).
A: 전체 스캔 스펙트럼 — 가장 큰 이온은 m/z 671.1136(z = 9)이고 755.1274(z = 8), 603.9011(z = 10) 등이 뒤따릅니다. 원문은 이 스펙트럼에서 신호 세기·전하 상태·단편화 적합성을 보고 MRM 전구 이온을 골랐다고 적었습니다. B: 여러 전이의 크로마토그램 — 그림 라벨상 피크가 3.552~3.555분에 함께 나옵니다.
Figure 2. Clarity OTX Pro (10 mg/well) linearity of lipid-conjugate ASO in plasma.
분석 대상/IS 피크 면적비의 검량선(y = 2.5506x + 0.0293, R² = 0.9987). 가로축 표기는 원문 그대로 "Conc (ng/mL) Ratio"(0~10)입니다 — 첨가 농도(5~2500 ng/mL)가 아니라 IS 대비 농도비로 읽히며, IS 농도는 원문에 수록되지 않았습니다.
⚠️ 원문 대조 메모
- 본문은 CV가 "대체로 15% 미만"이라고 요약하지만, 2500 ng/mL의 CV는 15.72%입니다. 35·75 ng/mL도 14%대입니다.
- Table 1의 표준편차 열은 단위가 없고, 측정 농도(ng/mL)와 CV로 되짚으면 맞지 않습니다(예: 2500 ng/mL에서 CV 15.72%인데 표준편차 3.64). 농도가 아닌 다른 척도(면적비 등)의 표준편차로 보이나 원문은 밝히지 않았습니다.
- Figure 1B의 피크(약 3.55분)는 원문 그래디언트 표에서 %B가 5%로 유지되는 구간(0~4분)에 있습니다. 시스템 지연 부피 등 이 관계를 설명하는 정보는 원문에 없습니다.
- 사용한 10 mg/well 플레이트의 주문 번호는 본문에 특정되지 않았습니다. 주문 정보에는 Clarity OTX 10 mg Plate와 Clarity OTX Pro Extraction Kit(100 mg/96-well plate and buffers)가 따로 실려 있습니다.
이 페이지에 요약만 한 MS 파라미터 전체 표(가스·소스 온도·Zeno trap·누적 시간 등)와 Biozen Oligo 치수별·Clarity OTX 포맷별 주문 정보(Lysis Loading·Elution Buffer, Proteinase K Kit, 2~100 mg 플레이트, 튜브, 매니폴드)는 원문에 있습니다.
Phenomenex 원문 보기 (TN-1434)데이터 해석 및 실무 제언
- 낮은 농도 쪽 회수율을 먼저 보세요. 5~20 ng/mL 회수율은 75.60~86.95%, 150 ng/mL 이상은 93.43~109.75%입니다. 원문은 이를 저농도의 매트릭스 억제 그리고/또는 고농도의 추출 회수 향상 "가능성"으로만 적었고 원인을 확인하지는 않았습니다.
- "증발 없음"은 "농축 없음"이기도 합니다. 혈장 20 µL 상당을 로딩해 50 µL × 2로 용출하므로, 용출액 부피는 혈장 상당량의 약 5배입니다(컬럼피아 계산). 더 낮은 LLOQ가 필요하면 용출 부피가 작은 포맷을 검토할 수 있으나, 지질 결합 ASO에서 그 효과는 이 원문이 시험하지 않았습니다.
- 이동상 B의 이소프로판올을 빼먹지 마세요. 원문 B는 아세토니트릴/물/이소프로판올 60:20:20입니다. 원문은 이 조성을 고른 이유를 적지 않았으므로, 조성을 바꿀 때는 우리 랩에서 머무름·회수를 다시 확인하십시오.
같은 Clarity OTX 계열, 무엇이 다른가
GalNAc-siRNA 혈장·간 조직 SPE(TN-1414)는 같은 Clarity OTX Pro로 이중가닥 siRNA(안티센스·센스 가닥)를 혈장과 간 조직에서, 10 mg/well과 2 mg/well 포맷을 비교했습니다. 이 페이지(TN-1434)는 지질 결합 단일가닥 ASO를 혈장에서 10 mg/well 한 포맷으로만 다루며, 원문이 강조한 것은 지질 결합체를 증발 단계 없이 처리하는 점입니다.
혈장 SSO 분석(Clarity OTX + Biozen Oligo)은 지질이 붙지 않은 2′-MOE PS 올리고를 원숭이 혈장에서 Pro가 아닌 Clarity OTX로 추출한 자료입니다. 매트릭스 종·키트·분석 대상이 다르므로 회수율 숫자를 서로 직접 견주지 마십시오.
올리고 생체분석 — 전처리부터 분리까지 모아 보기
ASO·siRNA의 SPE 전처리, 이온쌍 역상 분리, 컬럼 선택 자료를 올리고뉴클레오타이드 분석 솔루션에 정리했습니다.
올리고뉴클레오타이드 분석 솔루션 보기참고 자료 및 원문
TN-1434: Optimized Solid-Phase Extraction of Lipid-Conjugated ASO from Plasma Using Clarity OTX Pro
Roxana Eggleston-Rangel, Namrata Saxena, Lucia Geis Asteggiante, Ph.D. (Phenomenex, Inc., Torrance, CA)
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