와인 유기산 7종 HPLC-UV - Synergi Hydro-RP
(Kinetex F5 스크리닝과 비교 · 시킴산/말산 분리 · 6분 분리, 세척 포함 총 10분)
TN-1189 · Phenomenex Technical Note (© 2015)
30초 요약
첫 스크리닝: 시킴산이 말산과 겹침
Kinetex 2.6 µm F5 코어셀 컬럼은 표준품에서는 잘 작동했지만, 원문은 알려진 간섭 성분 시킴산이 말산과 함께 용출했다고 적었습니다
최종 방법: Synergi Hydro-RP, 6분 분리
pH 1.5 인산칼륨·60 °C에서 7종을 6분 안에 분리하고, 매트릭스 세척 구배를 넣어 총 10분입니다. 표준품 % RSD는 표 기준 모두 5 % 미만입니다
와인 8종: 숙신산은 정량 못 함
타르타르산은 8종 모두 1.19~2.23 mg/mL로 정량됐고, 말산은 2종에서만 검량 하한 이상이었습니다. 숙신산은 매트릭스 간섭으로 정량되지 않았습니다
🛋️ The Interpreter: 기술 용어 쉽게 풀기
🧪 왜 pH 1.5인가
원문 서론은 유기산이 비교적 극성인 화합물이라 역상 분리에 어려움이 있다고 적었습니다. 원문은 pH 1.5의 산성 이동상으로 유기산을 양성자화해야 역상 메커니즘으로 머무르는 데 도움이 된다고 설명합니다. 최종 방법의 이동상 A는 20 mM 인산칼륨(pH 1.5)이고, 메탄올(B)은 구배표상 2.5~3.0분 구간에만 들어갑니다.
🔀 F5와 Hydro-RP는 무엇이 다른가
원문 표기로 Kinetex F5는 코어셀 펜타플루오로페닐(PFP) 고정상, Synergi Hydro-RP는 극성 엔드캡핑(polar endcapped) 고정상입니다. 원문은 Hydro-RP를 고른 이유와 pH 1.5에서의 머무름을 모두 «고정상의 수소결합 공여 능력»으로 설명하고, 두 방법을 «orthogonal(직교)»이라 부릅니다. 두 조건 상자의 피크 번호는 시킴산·말산 순서가 서로 바뀌어 있습니다(아래 조건표).
🍇 시킴산과 «0†»
원문은 시킴산(Shikimic acid)을 와인의 «알려진 간섭 성분»으로 부르고, Synergi 방법 개발에서 온도 검토가 시킴산 분리 개선에 도움이 되었다고 적었습니다. 원문 서론은 타르타르산·말산을 특히 중요한 산으로, 아세트산·시트르산·숙신산을 산도와 풍미에 기여하는 산으로 소개합니다. 와인 결과표(Table 2)의 «0†»는 «0으로 측정됨»이 아니라 «검량선 최저 농도(Standard 1) 미만이라 제외»라는 원문 표기입니다.
조건 요약 — 스크리닝 방법과 최종 방법
| 항목 | 스크리닝 (Kinetex F5, Figure 1) | 최종 (Synergi Hydro-RP, Figure 2·3) |
|---|---|---|
| 컬럼 | Kinetex 2.6 µm F5, 100Å | Synergi 4 µm Hydro-RP 80Å |
| 치수 / 품번 | 150 x 4.6 mm / 00F-4723-E0 | 250 x 4.6 mm / 00G-4375-E0 |
| 이동상 | 20 mM Potassium Phosphate, pH 1.6 | A: 20 mM Potassium Phosphate, pH 1.5 / B: Methanol |
| 구배 (Time min / %B) | 구배표 없음(조건 상자에 이동상 1종만 기재) | 0/0 · 2.5/0 · 2.6/30 · 2.9/30 · 3.0/0 · 10/0 |
| 유속 | 1.25 mL/min | 1 mL/min |
| 온도 | Ambient | 60°C |
| 검출 | UV @ 210 nm | UV @ 210 nm (ambient) |
| 주입량 | 10 µL | 20 µL |
| 피크 번호 순서 | 1 Tartaric · 2 Shikimic · 3 Malic · 4 Lactic · 5 Acetic · 6 Citric · 7 Succinic | 1 Tartaric · 2 Malic · 3 Shikimic · 4 Lactic · 5 Acetic · 6 Citric · 7 Succinic |
| 기기·전처리 | Agilent 1100 system (DAD), ChemStation · 표준품: 물에 조제 후 이동상 A로 1:10 희석 · 와인: 이동상으로 1:10 희석 후 Phenex 0.2 µm 시린지 필터(P/N AF0-3203-12) | 왼쪽과 같음(원문 Materials and Methods에 두 방법 구분 없이 기재) |
※ 원문은 늦게 나오는 매트릭스 간섭의 이월(carryover)을 막으려고 구배 세척 단계를 넣었고, 총 분석 시간이 10분으로 늘었지만 기존에 보고된 방법보다는 짧다고 적었습니다(원문 발간 당시, 2015 기준 서술). ※ 구배표의 30 %B 구간은 2.6~2.9분으로 프로그램되어 있고, Figure 3의 7개 피크는 판독상 약 2.9~5.4분에 나옵니다(컬럼피아 판독). 실제 도달 시점은 펌프–컬럼 체류 부피와 컬럼 통과 시간(Figure 3 보이드 교란 약 2.4분, 컬럼피아 판독)만큼 늦고 원문에 수록되지 않았으므로, 구배표 시각을 크로마토그램 시각에 직접 겹쳐 읽지 마십시오. 다른 기기로 옮길 때는 이 구간이 피크와 어떻게 겹치는지 확인하십시오. ※ 최종 방법의 검출 항목은 원문에 «UV @ 210 nm (ambient)»로 적혀 있고 컬럼 온도는 60°C입니다. 원문 표기 그대로 옮겼습니다.
두 방법의 조건 상자 원본과 Kinetex·Synergi 주문 정보(치수별 품번)는 원문에 있습니다. 품번은 원문 발간 당시(2015) 표기이므로 현재 품번은 제품 페이지에서 확인하십시오.
Phenomenex 원문 보기 (TN-1189)
Figure 1. Acid Standards Screening Method using Kinetex 2.6 µm F5 Core-Shell Column
Kinetex F5 스크리닝의 표준품 크로마토그램. 피크 2(시킴산)와 3(말산)이 판독상 약 1.7분 부근에서 거의 겹쳐 나오고, 마지막 피크 7(숙신산)은 약 3.2분입니다(컬럼피아 판독). 세로축은 원문 표기 «Norm.»(정규화)라 피크 높이로 성분 간 감도를 비교할 수는 없습니다.
Figure 3. Organic Acid Standard (Calibrator Level 5 - High)
Synergi 4 µm Hydro-RP 최종 방법의 최고 농도 검량 표준. 피크 1~7(타르타르산·말산·시킴산·젖산·아세트산·시트르산·숙신산)이 판독상 약 2.9·3.4·3.7·4.0·4.4·5.1·5.4분에 나옵니다(컬럼피아 판독). 원문은 Figure 2(최저 농도)·3에서 모든 성분이 기준선 분리되었다고 적었습니다.
결과 요약 ① 표준품 검량 (원문 Table 1)
| 성분 | 기대 농도 Standard 1~5 (mg/mL) | % RSD (3회) | % Error for Standards |
|---|---|---|---|
| Tartaric Acid | 0.5 ~ 5 | 0.31 ~ 1.43 | −1.74 ~ 1.75 |
| Malic Acid | 0.5 ~ 5 | 0.46 ~ 1.95 | −2.71 ~ 2.59 |
| Shikimic Acid | 0.005 ~ 0.05 | 0.05 ~ 0.64 | −1.90 ~ 2.79 |
| Lactic Acid | 0.25 ~ 2.5 | 0.26 ~ 0.67 | −2.26 ~ 3.74 |
| Acetic Acid | 0.25 ~ 2.5 | 0.04 ~ 0.63 | −1.14 ~ 2.30 |
| Citric Acid | 0.025 ~ 0.25 | 0.12 ~ 3.38 | −4.38 ~ 7.63 |
| Succinic Acid | 0.25 ~ 2.5 | 0.51 ~ 1.21 | −0.75 ~ 1.40 |
※ 원문 Table 1의 35개 행(7성분 × 5농도)을 성분별 최솟값~최댓값으로 묶은 것입니다(컬럼피아 정리). 검량은 피크 높이 기준이며, 원문 본문은 모든 표준의 상관계수가 0.99를 넘었다고 적었습니다(표에는 상관계수 값이 없음). 제조사 (Phenomenex) 기술노트의 값이며 컬럼피아가 재현한 값이 아닙니다.
결과 요약 ② 와인 8종 계산 농도 (mg/mL, 원문 Table 2)
| Wine | Tartaric | Malic | Shikimic | Lactic | Acetic | Citric | Succinic |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Mixed Red | 1.51 | 0† | 0.0234 | 1.83 | 0.37 | 0.0708 | 0† |
| Cabernet Sauvignon C | 1.67 | 0† | 0.0280 | 1.6 | 0.53 | 0† | 0† |
| Cabernet Sauvignon P | 1.84 | 0† | 0.0408 | 1.39 | 0.73 | 0† | 0† |
| Bordeaux | 1.19 | 0† | 0.0257 | 1.34 | 0† | 0.0408 | 0† |
| Pinot Noir | 1.85 | 0† | 0.0177 | 2.07 | 0.61 | 0† | 0† |
| Chardonnay | 2.17 | 0† | 0.0182 | 2.47 | 0† | 0† | 0† |
| Sauvignon Blanc | 2.23 | 1.25 | 0.0079 | 0.52 | 0.36 | 0.0443 | 0† |
| Chablis | 1.58 | 0.91 | 0.0288 | 2.79 | 0† | 0.0405 | 0† |
※ † = excluded because concentration is below standard 1 level(원문 각주). 8종 × 7성분 56칸 중 21칸이 «0†»입니다 — 말산 6칸, 숙신산 8칸, 시트르산 4칸, 아세트산 3칸(컬럼피아 집계). 원문은 각 와인을 3회 분석했고 성분은 머무름 시간으로 동정했습니다. 표의 값이 1:10 희석을 보정한 값인지는 원문에 수록되지 않았습니다.
⚠️ 원문 대조 메모
- 원문 본문은 «% RSD for all standards were below 5% with the exception of one data point for Citric acid (7.63%)»라고 적었으나, Table 1에서 7.63은 Citric Acid Standard 1의 % Error 값이고 같은 행의 % RSD는 3.38입니다. 표의 % RSD 35개는 모두 5 % 미만(최대 3.38)이고, 절댓값 5 %를 넘는 % Error는 35개 중 이 1개뿐입니다(컬럼피아 대조). 이 페이지는 표 값을 그대로 옮겼습니다.
- 원문은 «Figure 3» 번호를 두 번 썼습니다 — 최고 농도 검량 표준(2쪽)과 Mixed Red 와인(4쪽). 본문도 «Figures 2 and 3»을 검량 표준으로, «Figures 3 - 10»을 와인 8종으로 가리킵니다. 이 페이지의 Figure 3은 검량 표준 쪽입니다.
- 원문 서론은 정확히 정량할 수 있는 산에 숙신산을 넣었지만, 결과에서는 매트릭스 간섭 때문에 와인 시료의 숙신산을 정량하지 못했다고 적었습니다(늦게 나오는 숙신산에서 특히 그랬다고 씀). Table 2의 숙신산은 8종 모두 «0†»(standard 1 미만으로 제외)로만 표기되어, 표에서는 매트릭스 간섭이 따로 구분되지 않습니다.
- Table 2의 제목은 «Calculated Concentrations for Organic Acid Standards»이지만 행은 와인 시료입니다. 또 Chablis의 젖산 2.79 mg/mL는 젖산 최고 검량 농도(Standard 5, 2.5 mg/mL)보다 높아, 숫자로 보고된 35칸 중 검량 최고 농도를 넘는 유일한 값입니다(컬럼피아 대조). 원문은 이 값을 따로 논의하지 않았습니다.
이 페이지에 싣지 않은 Figure 2(최저 농도 검량 표준), 와인 8종 크로마토그램(Figures 3 - 10), 그리고 Table 1의 반복 측정 피크 높이·계산 농도 전체는 원문에서 확인하십시오.
Phenomenex 원문 보기 (TN-1189)데이터 해석 및 실무 제언
- 말산이 목적 성분이면 시킴산부터 보세요. Kinetex F5 스크리닝에서는 시킴산이 말산과 함께 용출했고, Synergi Hydro-RP 최종 방법에서는 말산(2)·시킴산(3)이 따로 표시되며 원문은 모든 성분이 기준선 분리되었다고 적었습니다. 원문은 온도 검토가 시킴산 분리 개선에 도움이 되어 60 °C를 택했다고 설명합니다.
- pH 1.5·60 °C는 컬럼 사용 범위를 먼저 확인하세요. 원문은 60 °C를 «컬럼 안정성 범위의 높은 쪽»이라고 표현했습니다. 강산성 이동상과 함께 쓰는 조건이므로, 우리 랩 컬럼의 사용 범위는 제품 문서로 확인하십시오.
- 숙신산은 이 방법만으로 와인에서 정량되지 않았습니다. 원문 결론은 추가 간섭 성분의 동정·정량과 고체상 추출(SPE) 같은 다른 전처리를 후속 연구로 제안합니다. 숙신산이 필요하면 전처리 검토가 먼저입니다.
- 동정은 머무름 시간뿐입니다. 원문은 성분을 RT로 동정했고, 특이성(specificity) 평가는 후속 과제로 남겼습니다. 새 매트릭스(다른 와인·과즙)에 쓸 때는 공용리 간섭 확인이 필요합니다.
- 고농도 시료는 검량 범위를 넘지 않게 희석하세요. 원문 Table 2에서 Chablis 젖산(2.79 mg/mL)은 Standard 5(2.5 mg/mL)보다 높습니다. 원문은 작은 매트릭스 간섭이 문제되지 않으면 유속을 높여 분석을 줄일 수 있다고도 적었지만, 그 조건의 데이터는 싣지 않았습니다.
결정 가이드 — 원문이 제시한 두 방법 중 무엇을 볼까
| 우리 랩의 목적 | 원문에서 볼 방법·수치 |
|---|---|
| 말산 정량이 필요 없는 빠르고 간단한 스크린 | Kinetex F5 스크리닝 — 원문 결론은 빠른 스크린이 필요할 때, 특히 말산이 문제되지 않을 때 관심을 둘 만하다고 적음 · 마지막 피크 판독 약 3.2분 |
| 말산·시킴산을 포함한 7종 분리 | Synergi 4 µm Hydro-RP 최종 방법 — 6분 분리, 세척 구배 포함 총 10분 |
| 와인 숙신산 정량 | 원문 방법으로는 정량되지 않음(Table 2 전부 «0†») — 전처리 추가 검토 필요 |
이 원문의 컬럼 — Synergi Hydro-RP
원문 최종 방법이 쓴 Synergi 4 µm Hydro-RP 80Å(250 x 4.6 mm)를 포함한 Synergi 제품군 정보를 제품 페이지에 정리했습니다.
Synergi 보기참고 자료 및 원문
TN-1189: Fast and Robust Analysis of Organic Acids from Wine using HPLC-UV
Laura Snow, Matt Trass, Michael Klein, Sean Orlowicz, and Brian Rivera (Phenomenex, Inc., Torrance, CA)
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