혈청 10 µL 항우울제 22종 LC-MS/MS - Strata-X-CW 마이크로엘루션 SPE
(Kinetex 2.6 µm Biphenyl)
TN-0165 · Phenomenex Technical Note
30초 요약
혈청 10 µL · 2 mg/well
Strata-X-CW 마이크로엘루션 플레이트에 산성 로딩·염기 용출(원문 «AB 조건»). 용출은 50 µL × 2회입니다
증발·재용해 생략 → 희석 후 주입
원문 비교표 기준 증발+재용해 ≅ 36분 → ≅ 1분/플레이트, 총 시약 585.6 → 124.8 mL/플레이트(원문 결론: 약 460 mL 절감)
회수율 72~127% · R² ≥ 0.993
10·40·400 ng/mL, N = 4. 단 둘록세틴은 원문이 %CV(34%)·공정 효율(42%)·정밀도(25%)의 예외로 밝혔습니다
🛋️ The Interpreter: 기술 용어 쉽게 풀기
💧 마이크로엘루션 SPE
원문 서론은 세척·용출에 드는 용매가 적은 SPE 형식으로 소개하며, «일반적인» 세척 부피를 100~200 µL, 용출 부피를 50~100 µL로 들고 용출액이 적어 증발 대신 희석만으로 주입할 수 있다고 설명합니다. 이 노트의 실제 값은 2 mg/well 플레이트, 세척 200 µL × 2단계, 용출 50 µL × 2회, 희석 200 µL입니다.
🧲 왜 Strata-X-CW인가
원문은 22종이 소수성이 중간~높고(logP 2.2~5.1) 염기성이 강해(pKa 7~10.5) 약한 양이온 교환 흡착제 Strata-X-CW가 맞는다고 적습니다. 50% 메탄올 세척에서 손실이 없었다는 근거로는 가장 극성인 Hydroxybupropion의 회수율을 듭니다. 전처리 소모품이며 분석 컬럼이 아닙니다.
📐 회수율 · 매트릭스 효과 · PE
원문에 정의된 식은 회수율 하나입니다: 추출 전 첨가 ÷ 추출 후 첨가 × 100. 정밀도는 N = 4의 %CV입니다. 매트릭스 효과(%ME)와 공정 효율(PE)의 계산식은 원문에 별도 수록되지 않았습니다.
전처리 비교: 방법개발 30 mg vs 마이크로엘루션 2 mg (원문 Figure 2)
| 단계 | Strata-X 방법개발 플레이트 30 mg/well | Strata-X-CW 마이크로엘루션 2 mg/well (최종) |
|---|---|---|
| 시료 전처리 | 혈청 500 µL에 항우울제 표준 첨가(1 ng/mL, 둘록세틴만 6 ng/mL) + 25 mM 포름산암모늄(pH 4~5) 1 mL | 혈청 10 µL에 항우울제 표준·내부표준 첨가 + 25 mM 포름산암모늄(pH ~3.5) 200 µL |
| 플레이트 | Strata-X 방법개발 96웰, 30 mg/well (KS0-8209) — 표 2는 이 중 Strata-X-C 흡착제 | Strata-X-CW 마이크로엘루션 96웰, 2 mg/well (8M-S035-4GA) |
| 컨디셔닝 · 평형 | 메탄올 1 mL · 물 1 mL | 메탄올 200 µL · 물 200 µL |
| 로딩 | 전처리 시료 약 1.5 mL | 희석한 전처리 시료 200 µL |
| 세척 1 · 2 | 25 mM 포름산암모늄(pH 4~5) 1 mL · 메탄올/물(1:1) 1 mL | 산성 완충액 25 mM 포름산암모늄(pH ~3.5) 200 µL · 메탄올/물(1:1) 200 µL |
| 건조 | 20~25 in. Hg, 5~8분 | 20~25 in. Hg, 1분 |
| 용출 | 에틸아세테이트/이소프로판올/수산화암모늄(7:2:1) 300 µL × 2 | 5% 수산화암모늄 in 아세토니트릴/메탄올(60:40) 50 µL × 2 |
| 농축(Dry Down) | 40 °C 질소, 15~20분 · 시간 ≅ 25분 · 총 건조 ≅ 35분 | 생략(Bypass) · 총 건조 ≅ 1분 |
| 재용해 · 희석 | 초기 이동상 500 µL(내부표준 5 ng/mL 포함), ≅ 1분 | 재용해 생략 · 이동상 A(0.1% 포름산 수용액) 200 µL로 희석 후 주입 |
| 증발+재용해 총 시간 | ≅ 36분/플레이트 | ≅ 1분/플레이트 |
| 총 시약 부피 | 6.1 mL/well · 585.6 mL/plate | 1.3 mL/well · 124.8 mL/plate* |
* 원문 표기는 «124.8 mL/well»이나, 왼쪽 열(6.1 mL/well · 585.6 mL/plate)과 같은 96웰 환산(1.3 × 96 = 124.8)이라 plate로 읽었습니다. 두 열의 well당 합계는 각 단계 부피(전처리 완충액·컨디셔닝·평형·세척·용출·재용해 또는 희석)를 더한 값과 일치합니다(둘 다 컬럼피아 계산). 원문 결론은 30 mg SPE 방식 대비 플레이트당 30~40분과 약 460 mL의 완충액·용매를 줄인다고 적습니다. 원문은 증발 생략, 혈청·추출 용매 사용량 감소, 이 시간·부피 절감을 들어 «더 빠르고 효율적이며 더 지속가능한(more sustainable)» 워크플로라 부르고 자동화가 더 쉽다고 적습니다. 그 밖의 환경 지표는 원문에 수록되지 않았습니다.
LC-MS/MS 조건
| 항목 | 원문 조건 |
|---|---|
| 컬럼 | Kinetex 2.6 µm Biphenyl, 50 × 3.0 mm (00B-4622-Y0) — 코어셀 |
| 이동상 | A: 0.1% 포름산 수용액 · B: 0.1% 포름산 메탄올 |
| 구배 (%B) | 20(0.0 min) → 40(1.0) → 80(2.0) → 95(3.0) → 95(3.5) → 20(3.51) → 20(5.0) |
| 유속 · 주입 · 온도 | 0.7 mL/min · 5 µL · 40 °C |
| LC · 검출기 | Agilent 1260 Infinity · SCIEX 6500 Triple Quad (MS/MS) |
| MS/MS | ESI 양이온 · 소스 350 °C · GS1 55 psi · GS2 60 psi · CUR 35 psi · IS 2500 V |
| MRM | 22종 Q1/Q3 — 아래 성분 표(원문 표 1) |
※ 원문 서론은 앞선 작업에서 Strata-X 방법개발 96웰 플레이트로 Strata-X-C 흡착제(산성 로딩·세척, 염기 용출)가 최대 절대 회수율을 냈고(TN-0163), Kinetex 2.6 µm Biphenyl이 항우울제 LC 분리에 더 나은 선택이었다(TN-1356)고 적습니다. 마이크로엘루션 쪽 내부표준의 종류·농도는 원문에 별도 수록되지 않았습니다.
Figure 1. Analysis of Antidepressants Extracted from Serum Using Strata-X-CW Microelution Plate, Under Acidic Load and Basic Elution, on a Kinetex™ 2.6 µm Biphenyl Column. Spiked Concentration of Antipsychotics in Serum is 5 ng/mL.
최종 마이크로엘루션 추출물의 크로마토그램입니다. 원문 피크 표 기준 22종은 0.84분(Selegiline)부터 5.7분(Sertraline)까지 나오며, 피크 번호와 RT는 아래 표에 옮겼습니다. 캡션의 «Antipsychotics»는 원문 표기 그대로이고, 그림 제목과 본문은 항우울제 패널을 다룹니다.
22종 RT · MRM · 회수율 비교 (원문 Figure 1 · 표 1 · 표 2)
표 2는 흡착제(Strata-X-C vs Strata-X-CW)·용출 용매·첨가 농도(1 vs 10 ng/mL)가 모두 다른 두 방식을 나란히 둔 것입니다. 한 가지 변수만 바꾼 비교가 아닙니다.
| # | 성분 | RT (min) | Q1 → Q3 (Da) | 방법개발 X-C %Rec (%CV) | 마이크로엘루션 X-CW %Rec (%CV) |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | Selegiline | 0.84 | 188 → 91 | 10 (65) | 76 (11.4) |
| 2 | Hydroxybupropion | 1.1 | 256.2 → 238 | 81 (4.8) | 102 (5.8) |
| 3 | Bupropion | 1.4 | 240.3 → 184 | 35 (30.5) | 98 (5.7) |
| 4 | Venlafaxine | 1.7 | 278.1 → 121 | 84 (10.9) | 91 (3.7) |
| 5 | Mirtazapine | 1.8 | 266.1 → 195.2 | 79 (4.2) | 91 (2.9) |
| 6 | Citalopram | 2.6 | 325.1 → 109 | 81 (5.2) | 109 (3.8) |
| 7 | N-Desmethyl-Doxepin | 2.8 | 266.1 → 107 | 80 (5.5) | 89 (2.1) |
| 8 | Doxepin | 2.9 | 280.1 → 107 | 83 (1.9) | 101 (5.9) |
| 9 | Trazodone | 2.9 | 372.2 → 176 | 82 (7.3) | 99 (1.6) |
| 10 | Norfluoxetine | 3.3 | 296.1 → 134.1 | 82 (10.1) | 99 (11.4) |
| 11 | Fluoxetine | 3.3 | 310.1 → 44 | 78 (7.5) | 79 (5.2) |
| 12 | Amoxapine | 3.8 | 314 → 271 | 79 (6) | 98 (3.9) |
| 13 | Desipramine | 3.9 | 267.1 → 72 | 77 (7.1) | 77 (3.2) |
| 14 | Imipramine | 4.1 | 281.1 → 86 | 78 (7.8) | 95 (4.2) |
| 15 | Duloxetine | 4.2 | 298.1 → 44 | 112 (14.5) | 86 (25.8) |
| 16 | Nortriptyline | 4.3 | 264.1 → 233.1 | 78 (6.4) | 85 (5.3) |
| 17 | Paroxetine | 4.3 | 330 → 192.1 | 79 (3.1) | 86 (7.2) |
| 18 | Amitriptyline | 4.5 | 278.1 → 233.1 | 78 (2.8) | 90 (3.2) |
| 19 | Trimipramine | 4.8 | 295.1 → 100.1 | 74 (1.6) | 83 (2.9) |
| 20 | N-Desmethyl-Clomipramine | 5.6 | 301.1 → 72 | 73 (5.5) | 95 (2.7) |
| 21 | Clomipramine | 5.6 | 315.1 → 86.1 | 80 (4.8) | 87 (3.7) |
| 22 | Sertraline | 5.7 | 306.1 → 159 | 94 (10.9) | 81 (2.6) |
※ 노란 칸 = 마이크로엘루션 회수율이 방법개발 플레이트보다 낮은 성분(둘록세틴 112 → 86, 서트랄린 94 → 81)으로, 원문 표 2가 녹색으로 표시한 두 값과 같습니다. 데시프라민은 77로 같습니다(컬럼피아 대조). 원문 피크 표에서 RT 값이 같은 네 쌍(8·9, 10·11, 16·17, 20·21)은 Q1이 서로 다르며(표 1), 원문은 이 쌍들을 따로 논하지 않습니다.
최종 방법 성능 (원문 표 3, N = 4)
각 칸은 10 / 40 / 400 ng/mL 순서입니다. 검량 범위는 5~500 ng/mL(1/x 가중).
| 성분 | % Recovery | % CV | % Matrix Effect | PE | Precision | Accuracy | R² |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Selegiline | 76/72/99 | 11.4/14.3/12.2 | 102/66/71 | 74/71/71 | 11.3/14.6/9.9 | 92/97/96 | 0.995 |
| Hydroxybupropion | 102/108/95 | 5.8/5.2/6.4 | 102/105/96 | 109/102/87 | 7.4/5.3/4.6 | 103/102/96 | 0.999 |
| Bupropion | 98/101/97 | 5.7/8.4/3.7 | 98/98/95 | 85/80/76 | 7.5/8.5/6.5 | 95/97/94 | 0.998 |
| Venlafaxine | 91/97/98 | 3.7/4.7/5 | 97/96/87 | 95/97/86 | 3.9/3.7/0.5 | 97/101/92 | 0.999 |
| Mirtazapine | 91/101/98 | 2.9/2.6/6.1 | 112/101/91 | 106/109/91 | 3.2/2.7/5.5 | 99/107/92 | 0.997 |
| Citalopram | 109/127/106 | 3.8/5.6/7.5 | 109/120/107 | 102/111/89 | 4/1/11.8 | 101/106/94 | 0.997 |
| N-Desmethyl-Doxepin | 89/108/103 | 2.1/3.8/8.3 | 89/110/103 | 89/95/92 | 2.4/3.9/7.4 | 101/105/101 | 0.999 |
| Doxepin | 101/104/102 | 5.9/3.6/3.7 | 101/99/102 | 101/93/91 | 12.1/13.9/6.7 | 109/109/90 | 0.997 |
| Trazodone | 99/115/112 | 1.6/5.8/4 | 113/115/97 | 100/115/96 | 8.1/4.5/5.5 | 98/109/95 | 0.996 |
| Norfluoxetine | 99/82/102 | 11.4/13.1/24.4 | 84/84/92 | 99/85/79 | 9.3/11/17.8 | 101/83/98 | 0.994 |
| Fluoxetine | 79/102/116 | 5.2/9.7/16.1 | 79/104/117 | 104/112/119 | 4.2/9.7/15 | 102/101/115 | 0.997 |
| Amoxapine | 98/110/91 | 3.9/6.1/15.8 | 98/117/91 | 99/119/86 | 5/3.9/6.9 | 106/110/88 | 0.995 |
| Desipramine | 77/87/90 | 3.2/1.8/8.8 | 77/90/89 | 93/100/93 | 3.6/3.1/10.3 | 106/109/97 | 0.998 |
| Imipramine | 95/106/98 | 4.2/3.9/8 | 95/111/97 | 111/106/88 | 6.5/4.1/6.6 | 106/110/92 | 0.997 |
| Duloxetine | 86/91/104 | 25.8/33.8/20.6 | 74/54/78 | 42/50/71 | 25/12.8/20 | 91/104/114 | 0.993 |
| Nortriptyline | 85/88/107 | 5.3/2.9/12.1 | 82/91/102 | 97/98/97 | 6.2/3.1/8.8 | 107/107/93 | 0.998 |
| Paroxetine | 86/96/96 | 7.2/7.6/14.7 | 85/98/92 | 119/112/115 | 5.9/1.8/14.7 | 111/108/93 | 0.998 |
| Amitriptyline | 90/98/103 | 3.2/1/12.1 | 90/101/99 | 96/85/81 | 4/0.9/7.3 | 101/106/104 | 0.998 |
| Trimipramine | 83/87/88 | 2.9/9.2/11.3 | 95/87/91 | 83/86/88 | 4.1/7.9/7.6 | 88/106/85 | 0.996 |
| N-Desmethyl-Clomipramine | 95/107/100 | 2.7/5.7/19 | 70/82/100 | 87/107/103 | 3.2/6.1/15.2 | 103/112/95 | 0.997 |
| Clomipramine | 87/99/104 | 3.7/2.8/13.5 | 87/102/101 | 85/92/84 | 5.4/3.1/10.5 | 98/112/101 | 0.997 |
| Sertraline | 81/80/99 | 2.6/6.4/19.1 | 84/80/94 | 78/86/95 | 3.3/1.4/3.2 | 104/110/86 | 0.994 |
※ 66개 값의 범위(컬럼피아 집계): 회수율 72~127%, %CV 1.0~33.8%(둘록세틴 제외 시 1.0~24.4%), 매트릭스 효과 54~120% (둘록세틴 제외 66~120%), PE 42~119%(둘록세틴 제외 71~119%), 정밀도 0.5~25%(둘록세틴 제외 0.5~17.8%), 정확도 83~115%, R² 0.993~0.999. 원문 회귀식(표 3 마지막 열)은 싣지 않았습니다. 제조사(Phenomenex) 기술노트의 값이며 컬럼피아가 재현한 값이 아닙니다.
Figure 3. Calibration Curves for Four Selected Antidepressants Over 100-Fold Dynamic Range (5 ng/mL to 500 ng/mL).
원문이 고른 네 성분의 검량선입니다: 가장 소수성이 낮은 Hydroxybupropion(R² = 0.999), Norfluoxetine(0.994), 가장 소수성이 높은 Sertraline(0.994), Duloxetine(0.993). R² 값은 표 3과 같습니다. 그림 속 «Hydorybupropion»·«Setraline»은 원문 표기 그대로입니다.
⚠️ 원문 대조 메모 — 본문 서술과 표 값이 다른 곳
- 본문은 마이크로엘루션 회수율이 더 높지 않은 예외를 «Trazodone and Duloxetine»으로 적지만, 표 2에서 트라조돈은 82 → 99로 높고, 녹색 표시·낮아진 값은 둘록세틴과 서트랄린입니다.
- 본문은 Hydroxybupropion 회수율을 세 농도에서 96~102%라 적지만, 표 3 값은 102 / 108 / 95%입니다.
- 본문은 %CV가 둘록세틴을 빼면 24% 미만이라 적지만, 표 3의 Norfluoxetine 400 ng/mL은 24.4%입니다.
- 본문은 PE 예외를 둘록세틴 10 ng/mL(42%)만 적지만, 표 3의 둘록세틴 40 ng/mL PE도 50%입니다.
- 본문은 정확도를 93~115%라 적고 85~115% 기준 충족(둘록세틴 정밀도 제외)이라 하지만, 표 3의 최저값은 Norfluoxetine 40 ng/mL의 83%이고 93% 미만 값이 여러 개 있습니다.
- 표 3의 Imipramine과 Paroxetine 회귀식이 같은 값(y = 0.0551 x + 0.124)으로 실려 있고, 표 2 머리글(1 ng/mL)과 달리 Figure 2는 둘록세틴만 6 ng/mL로 첨가했다고 적습니다.
- 구배표는 5.0분에서 끝나는데 피크 20~22의 RT는 5.6~5.7분입니다. 원문에 이에 대한 설명은 없습니다.
이 페이지의 표는 원문 표 값을 그대로 옮겼습니다. 방법을 옮겨 쓰기 전에 원문을 확인하십시오.
이 페이지에 싣지 않은 표 3의 22종 회귀식, 원문 Figure 2 비교표의 원래 서식(방법개발 쪽 내부표준 목록 포함), Strata-X 마이크로엘루션 5종·방법개발 플레이트와 Kinetex 2.6 µm 미드보어 컬럼 주문 정보는 원문에 있습니다.
TN-0165 원문 보기데이터 해석 및 실무 제언
- 희석 주입의 대가를 감도로 확인하세요. 용출액 100 µL에 이동상 A 200 µL를 더해 주입하므로(컬럼피아 계산: 약 300 µL) 농축 단계가 없습니다. 원문 검량 하한은 5 ng/mL이며, 그보다 낮은 농도에서의 성능은 원문에 수록되지 않았습니다.
- 용출 용매는 «직접 주입 가능 여부»로 고르세요. 원문은 방법개발 플레이트의 에틸아세테이트/이소프로판올/수산화암모늄(7:2:1)이 회수율은 좋았지만 마이크로엘루션 직접 주입에는 적합하지 않았다고 적고, 5% 수산화암모늄 아세토니트릴/메탄올(60:40)로 바꿨습니다.
- 둘록세틴은 별도 검토 대상입니다. 표 3에서 %CV 25.8 / 33.8 / 20.6%, PE 42 / 50 / 71%, 10 ng/mL 정밀도 25%입니다. 원문 본문이 예외로 명시한 성분이며, 원인은 설명하지 않았습니다. Norfluoxetine도 표 3에 %CV 24.4%(400 ng/mL)·정확도 83%(40 ng/mL)가 있어 함께 확인할 만합니다(위 대조 메모).
- 용도 범위를 지키세요. 원문은 «FOR RESEARCH USE ONLY. Not for use in clinical diagnostic procedures.»(PHEN-RUO-00222)로 명시하고, 결론에서도 «clinical research»용 워크플로로 소개합니다. 이 페이지는 분석법 해설이며 치료 농도·판정 기준은 다루지 않습니다.
같은 Kinetex Biphenyl, 다른 전처리 — TDM 47종 페이지와의 차이
혈청 TDM 47종 LC-MS/MS(TN-0159)는 Phree 인지질 제거로 전처리하고 Kinetex 2.6 µm Biphenyl 100 × 2.1 mm를 쓴 자료이고, 이 페이지는 Strata-X-CW 마이크로엘루션 SPE와 50 × 3.0 mm 컬럼으로 항우울제 22종만 다룹니다. 전처리 원리·패널·컬럼 치수가 다르므로 회수율 숫자를 두 자료 사이에서 직접 견주지 마십시오.
참고 자료 및 원문
TN-0165: Fast, Efficient, and More Sustainable Extraction of 22 Antidepressants from Serum using Microelution SPE for LC-MS/MS Analysis
Shahana Wahab Huq, Stephanie Marin, PhD, and Bryan Tackett, PhD (Phenomenex, Inc., Torrance, CA)
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