곰팡이독소 9종, 하나의 분석조건으로 동시에
식품공전 기반 Kinetex XB-C18 LC-MS/MS 동시분석
26TN-K-0002 · Sungmoon Systech & KIAST Technical Note
30초 요약
기존 8종 + DON = 9종
식품공전이 LC-MS/MS 동시분석으로 제시하는 8종(AFB1·AFB2·AFG1· AFG2, OTA, FB1·FB2, ZEA)에, 개별 시험법으로 관리되던 DON을 추가해 총 9종을 하나의 분석조건에서 동시분석
충분한 분리도·피크 형상
인접 피크 간 분리도 Rs=3.45~26.65로 baseline separation 기준(Rs≒1.5)을 크게 상회하고, peak asymmetry는 0.88~1.16으로 이상적 대칭 피크(As≒1)에 근접
약 7분 내 9종 검출
DON(2.92분)부터 OTA(6.89분)까지 전 성분이 약 7분 이내에 독립적인 피크로 검출되며, 이론단수는 5.5×10⁴~2.39×10⁵ 범위
공식 데이터 vs 컬럼피아 실무 인사이트
원문 실측 조건 (Raw Data)
- Kinetex XB-C18, 2.6 µm, 150 × 2.1 mm (00F-4496-AN)
- 이동상: 5 mM ammonium formate + 0.1% formic acid 를 포함한 A: DW / B: MeOH (식품공전 제시 조성)
- 유속 0.5 mL/min, 주입량 1 µL(식품공전 제시 주입량 대비 1/10 수준), 총 15분 gradient
- Thermo Scientific TSQ Altis, H-ESI negative/positive SRM. DON은 positive 모드 m/z 297 기준 검출
컬럼피아 실무 인사이트
- Core-Shell 2.6 µm 입자 → 짧은 확산거리와 효율적 물질전달로 높은 컬럼 효율과 좁은 피크 폭 확보 (이론단수 5.5×10⁴~2.39×10⁵)
- XB-C18의 잔류 실라놀 접근 억제 설계 → 이온성·염기성 성분에서 개선된 피크 형상 제공, 전 성분 As=0.88~1.16 유지
- 식품공전 이동상·gradient 조건 그대로 유지 → 컬럼만 교체하는 형태이므로 시험법 이관·재검증 부담 최소화
- 극성 폭이 매우 큰 DON부터 OTA·ZEA까지 한 조건에서 처리 → 개별 시험법 병행 운영에 따르는 소모품·시간 부담 감소
🛋️ The Interpreter: 기술 용어 쉽게 풀기
🍞 곰팡이독소 9종 동시분석은 왜 어려운가?
곰팡이독소는 DON처럼 극성이 매우 높은 화합물부터 OTA·ZEA처럼 상대적으로 소수성이 큰 화합물까지 물리화학적 특성이 매우 다양합니다. 한쪽에 조건을 맞추면 다른 쪽이 머무르지 않거나 너무 늦게 나오는 문제가 생깁니다. 게다가 구조적으로 가장 유사한 Aflatoxin B/G 계열은 분리도가 충분하지 않으면 정성·정량 신뢰성이 떨어집니다. 성격이 제각각인 9명을 한 줄로 세우되, 서로 겹치지 않게 간격까지 확보해야 하는 셈입니다.
🧬 Core-Shell & XB-C18이란?
Core-Shell(코어셀) 입자는 단단한 코어 위에 얇은 다공성 껍질을 입힌 구조로, 분석물질이 이동해야 하는 거리가 짧아 피크가 퍼지지 않고 좁게 유지됩니다. 여기에 XB-C18은 리간드 구조와 표면 처리를 통해 실리카 표면에 남아 있는 잔류 실라놀(silanol)로의 접근을 억제하도록 설계된 정지상입니다. 실라놀은 이온성·염기성 물질을 붙잡아 피크 꼬리(tailing)를 만드는 주범인데, 이를 막아 대칭적인 피크 형상을 얻을 수 있습니다.
실험 조건 및 데이터
분석 대상: 곰팡이독소 9종
* 앞의 8종은 식품공전에서 LC-MS/MS 동시분석으로 제시하는 대상이며, DON은 기존에 개별 시험법으로 관리되던 항목입니다. 각각의 표준용액은 식품공전 시험법에 따라 혼합하여 사용했습니다.
LC 용매 gradient 조건 (Table 1)
| Time (min) | Flow (mL/min) | %B (MeOH) |
|---|---|---|
| 0.0 | 0.5 | 5 |
| 0.5 | 0.5 | 5 |
| 2.0 | 0.5 | 40 |
| 9.0 | 0.5 | 100 |
| 11.5 | 0.5 | 100 |
| 12.0 | 0.5 | 5 |
| 15.0 | 0.5 | 5 |
* 이동상 A: 5 mM ammonium formate + 0.1% formic acid in DW / B: 5 mM ammonium formate + 0.1% formic acid in MeOH. 주입량 1 µL, LC System: Thermo Scientific TSQ Altis MS, Detection: SRM.
이온원 조건 (Table 2)
| Parameter | Value |
|---|---|
| Ion Source | H-ESI |
| Spray Voltage (Positive) | 3,500 V |
| Spray Voltage (Negative) | 2,500 V |
| Sheath Gas | 50 (Arb) |
| Aux Gas | 10 (Arb) |
| Sweep Gas | 1 (Arb) |
| Ion Transfer Tube Temp. | 325 °C |
| Vaporizer Temp. | 350 °C |
DON 특성이온 조건 (positive 모드)
| Precursor | Product (m/z) | CE |
|---|---|---|
| m/z 297 | 177.1 | 23 |
| m/z 297 | 203.1 | 19 |
| m/z 297 | 249.1 | 14 |
* 식품공전에 제시된 8종의 곰팡이독소는 공전의 특성이온 조건을 사용했으며, 개별관리되는 DON만 positive 이온 모드에서 위 조건으로 검출했습니다.
크로마토그래피 성능 비교 (Table 3)
9종
동시분석 대상
3.45~26.65
인접 피크 분리도 Rs
0.88~1.16
Peak Asymmetry (As)
약 7분
9종 전체 분석시간
Kinetex XB-C18 (2.6 µm, 150 × 2.1 mm)
| Name | RT (min) | ΔRT | Width 50% (min) | As | Rs | Theoretical Plates |
|---|---|---|---|---|---|---|
| DON | 2.92 | 1.31 | 0.029 | 0.9 | 26.65 | 54,954 |
| AFG2 | 4.23 | 0.19 | 0.029 | 1 | 3.7 | 116,308 |
| AFG1 | 4.42 | 0.26 | 0.031 | 1.03 | 4.83 | 113,655 |
| AFB2 | 4.68 | 0.19 | 0.032 | 1.15 | 3.67 | 118,090 |
| AFB1 | 4.87 | 0.66 | 0.032 | 0.91 | 12.23 | 131,290 |
| FB1 | 5.53 | 0.93 | 0.031 | 1.16 | 17.53 | 173,515 |
| FB2 | 6.46 | 0.23 | 0.032 | 0.88 | 4.13 | 231,308 |
| ZEA | 6.69 | 0.2 | 0.034 | 1.09 | 3.45 | 209,219 |
| OTA | 6.89 | - | 0.033 | 0.92 | - | 239,214 |
Conventional C18 (식품공전 제시, 3 µm, 150 × 3.0 mm)
| Name | RT (min) | ΔRT |
|---|---|---|
| DON | - | - |
| AFG2 | 6.11 | 0.28 |
| AFG1 | 6.39 | 0.32 |
| AFB2 | 6.71 | 0.26 |
| AFB1 | 6.97 | 0.78 |
| FB1 | 7.75 | 0.98 |
| FB2 | 8.73 | 0.23 |
| OTA | 8.96 | 0.21 |
| ZEA | 9.17 | - |
* Resolution은 반높이 피크 폭 기준 USP 식으로 계산되었습니다. 식품공전에 제시된 일반 C18 컬럼 조건에서는 DON이 동시분석 대상에 포함되지 않아 해당 값이 기재되어 있지 않습니다.
Figure 1. Chromatograms of mycotoxin standards. Upper: Representative chromatograms presented in the Korean Food Code using a conventional C18 column (3 µm, 150 × 3.0 mm), and Lower: using Kinetex XB-C18 (2.6 µm, 150 × 2.1 mm).
식품공전에 제시된 일반 C18 컬럼의 대표 크로마토그램(upper)과, 동일한 이동상·gradient 조건에서 Kinetex XB-C18을 적용해 얻은 크로마토그램(lower)의 비교입니다. Kinetex XB-C18에서는 DON부터 OTA까지 모든 분석 대상 성분이 약 2.92~6.89분 범위에서 검출되었고, 각 성분은 독립적인 피크로 확인되었습니다. 기존 공전에서 개별 시험법으로 관리되는 DON을 포함했음에도 기존 8종과의 피크 중첩 없이 하나의 분석조건에서 총 9종의 동시분석이 가능함을 보여줍니다.
데이터 해석 및 실무 제언
8종 시험법을 9종으로 확장하는 의미
식품공전은 AFB1·AFB2·AFG1·AFG2, OTA, FB1·FB2, ZEA의 총 8종을 LC-MS/MS로 동시분석하도록 제시하고 있으며, DON은 별도의 개별 시험법으로 관리되고 있습니다. 본 방법은 공전의 이동상 및 gradient 조건을 변경하지 않은 상태에서 Kinetex XB-C18을 적용해, 기존 8종에 DON을 추가한 총 9종을 하나의 분석조건으로 처리할 수 있음을 보였습니다. 개별 시험법을 병행 운영할 때 발생하는 별도의 전처리·분석 시간과 소모품 부담을 줄일 수 있는 실용적 대안입니다.
구조 유사 계열의 분리도 확보
구조적으로 가장 유사해 분리 난이도가 높은 Aflatoxin 계열은 AFG2 → AFG1 → AFB2 → AFB1 순으로 순차적으로 용출되었으며, 이 구간에서도 최소 Rs=3.67 이상의 분리도를 나타내 정성 및 정량 분석에 충분한 분리 성능을 확보했습니다. FB1, FB2, ZEA 및 OTA 역시 각각 독립적인 피크를 형성했습니다. 전 성분의 peak asymmetry가 0.88~1.16 범위로 나타난 점은, 극성 차이가 큰 성분들을 동시에 분석하는 조건에서도 심한 peak tailing 또는 fronting 없이 안정성이 유지되었음을 의미합니다.
정지상 선택성 차이에 따른 상대 용출 거동
Figure 1에서 확인할 수 있듯이, OTA와 ZEA의 상대적 용출 순서는 일반 C18 컬럼과 Kinetex XB-C18에서 서로 다르게 나타났습니다. 식품공전의 일반 C18 컬럼에서는 OTA가 ZEA보다 먼저 용출되는 반면 (Figure 1, upper), Kinetex XB-C18에서는 ZEA가 먼저 용출되고 OTA가 이후에 검출되었습니다(Figure 1, lower). 이러한 용출 순서의 변화는 분석법의 이상 현상이 아니라 정지상 선택성(selectivity)의 차이에 기인한 정상적인 현상으로 해석됩니다.
동일한 C18 계열이라 하더라도 리간드 구조, 결합 밀도, 잔류 실라놀의 접근성, 표면 차폐 구조 및 phase ratio의 차이에 따라 분석물질에 대한 상대 선택성이 달라질 수 있습니다. OTA는 carboxylic acid, amide 및 phenolic group을 포함하는 반면, ZEA는 resorcyclic acid lactone 골격을 가져 두 물질은 이온화 특성과 정지상에 대한 상호작용 양상이 서로 다릅니다. 그러나 이러한 선택성 변화에도 불구하고 ZEA와 OTA 사이의 분리도는 Rs=3.45로 baseline separation 기준을 충분히 만족했으며, As 역시 각각 1.09와 0.92로 양호한 피크 형상을 유지했습니다. 따라서 용출 순서의 변화는 정성 및 정량 분석 성능을 저하시키는 요인으로 판단되지 않았습니다.
전문가 제언
01. 식품공전 이동상·gradient 조건을 그대로 유지하십시오
본 방법의 핵심은 컬럼만 교체하고 공전이 제시하는 이동상 조성(0.1% formic acid + 5 mM ammonium formate)과 gradient를 변경하지 않았다는 점입니다. 조건을 임의로 바꾸면 시험법 이관 시 재검증 범위가 넓어집니다. 모든 용매는 LC-MS 분석용 등급을 사용하고, 이동상은 사용 전 초음파 탈기 및 여과 과정을 수행하십시오.
02. 컬럼 내경에 맞춘 주입량 조정
본 방법은 식품공전에서 제시하는 주입량 대비 1/10 수준인 1 µL를 주입했습니다. 공전의 일반 C18은 내경 3.0 mm인 반면 본 방법은 내경 2.1 mm 컬럼을 사용하므로, 주입량을 그대로 옮기면 과부하로 피크 형상이 무너질 수 있습니다. 컬럼 스케일에 맞춰 주입량을 환산해 적용하십시오.
03. DON의 positive 모드 설정과 용출 순서 재확인
DON은 개별관리 항목으로 positive 이온 모드(m/z 297 → 177.1 / 203.1 / 249.1)에서 검출되므로, 나머지 성분과 함께 분석하려면 이온 모드 전환 설정을 반드시 확인해야 합니다. 또한 정지상이 바뀌면 성분 간 상대 머무름이 달라질 수 있으므로, 실제 도입 시에는 개별 표준품으로 각 성분의 머무름 시간과 용출 순서를 먼저 확인한 뒤 정량에 들어가는 것을 권장합니다.
참고 자료 및 원문
26TN-K-0002: 식품공전 기반 Kinetex XB-C18 컬럼을 이용한 곰팡이독소 9종의 LC-MS/MS 동시분석 (Simultaneous Determination of Nine Mycotoxins Using a Kinetex XB-C18 Column under Korean Food Code LC-MS/MS Conditions)
Jaeyeong Choi, Ph.D., Heonjoo Ham — Sungmoon Systech Corp. & Korea Institute of Analytical Science and Technology (KIAST)
[PDF] 26TN-K-0002 기술노트 원문 다운로드※ Phenomenex 웹사이트의 외부 공개 링크는 별도 수록되지 않았습니다.
연관 기술자료
이 솔루션과 관련된 애플리케이션 노트 및 기술 문서