유도체화 없는 혈청 에스트론·에스트라디올 LC-MS/MS 정량
(Strata SE SLE 전처리 · 컬럼 4종 스크리닝 · Kinetex Biphenyl, TN-1408)
TN-1408 · Phenomenex Technical Note (2026년 1월 PDF, © 2025 표기) · 연구용(RUO)
30초 요약
유도체화 단계 없이
E1·E2를 그대로 LC-MS/MS로 측정 — 검량 범위 E1 1~500 pg/mL, E2 5~500 pg/mL, 저농도 그림은 E1 5 pg/mL S/N 12
컬럼 4종 중 Biphenyl
같은 스크리닝 조건에서 E1·E2 간격: Luna Omega Polar C18 공용리 · Kinetex C18 0.1분 · F5 0.2분 · Biphenyl 약 1분
SLE 한 번, 주입 간격 5분
혈청 200 µL → Strata SE SLE(로딩·5분 대기·용출 2회) → 5분 그래디언트. 원문은 SPE보다 단계가 적다고 결론
공식 데이터 vs 컬럼피아 실무 인사이트
제조사 공식 데이터 (TN-1408)
- 시료: 사람 혈청 200 µL(호르몬 초저농도 확인 혈청 Mass Spec Gold, Golden West Diagnostics)
- 전처리: Strata SE SLE · 에틸아세테이트/헥산(9:1) 900 µL × 2 용출
- 컬럼 스크리닝(50 × 3.0 mm 4종): Luna Omega Polar C18 · Kinetex C18 · Kinetex F5 · Kinetex Biphenyl → Biphenyl이 E1·E2를 가장 잘 분리
- 검량: E1 R² = 0.99800, E2 R² = 0.993 (1/x 가중) · 주입 간격 5분 · Agilent 1290 Infinity + SCIEX 7500 Triple Quad
컬럼피아 실무 인사이트
- 코어셀 3종(C18·F5·Biphenyl)끼리도 간격이 0.126 → 0.218 → 0.875분으로 벌어졌습니다(그림 RT로 컬럼피아 계산). 이 분리에서 차이를 만든 것은 입자 구조보다 결합상 쪽으로 읽힙니다
- 용출 순서도 바뀝니다 — C18 계열 두 컬럼은 E1이 먼저, F5·Biphenyl은 E2가 먼저 나옵니다(그림 표시 RT 기준)
- 원문은 회수율·매트릭스 효과·정밀도·정확도와 정량한계(LLOQ) 정의를 싣지 않았습니다. 도입 전 자체 밸리데이션 항목입니다
- 전처리액 420 µL(혈청 200 µL + 내부표준 20 µL + 완충액 200 µL) 중 400 µL를 로딩하고 200 µL로 재용해하므로, 농축 배율은 약 0.95배(혈청 약 190 µL분)입니다(컬럼피아 계산). 원문이 든 감도 개선 전략 대부분이 이 배율과 주입량을 바꾸는 쪽입니다
🛋️ The Interpreter: 기술 용어 쉽게 풀기
🧬 왜 "유도체화 없이"가 뉴스인가
원문 서론은 E1·E2가 혈중 농도가 낮고, 이온화 효율이 나쁘고, 구조가 서로 비슷해 유도체화 없이 LC-MS로 직접 정량하기 어렵다고 적습니다. 그래서 감도를 얻으려고 분석물에 이온화가 잘 되는 작용기를 붙이는 유도체화가 흔히 쓰였습니다. 이 원문은 그 단계를 빼고 SLE 전처리와 MS/MS 감도로 해결하려는 시도입니다.
🔍 E1과 E2는 어디가 다른가
원문 구조도는 두 물질에서 딱 한 자리, 5원 고리 끝의 케톤(E1)과 하이드록시(E2)에 동그라미를 쳐 둡니다. 원문 표기로 LogP는 E1 4.3, E2 3.74이고 pKa는 둘 다 10.3입니다. 골격이 같아 분리가 쉽지 않은 쌍입니다.
🧪 SLE(지지 액-액 추출)
수성 시료를 플레이트의 지지체에 흡수시켜 두었다가 물과 섞이지 않는 유기용매(이 원문은 에틸아세테이트/헥산 9:1)를 흘려 분석물을 옮겨 담는 전처리입니다. 원문 절차에는 조건화·세척 단계가 없고 로딩 → 5분 대기 → 용출 2회로 끝납니다. 분리는 뒤의 분석 컬럼이 맡습니다.
🧱 코어셀 vs 완전다공성 · 결합상
Kinetex는 단단한 코어 위에 다공성 층을 입힌 코어셀, Luna Omega는 입자 전체가 다공성인 완전다공성 입자입니다. 입자 구조는 주로 효율(피크 폭)에, 결합상(C18·F5·Biphenyl)은 주로 선택성(누가 먼저·얼마나 떨어져 나오나)에 관여합니다. 원문은 F5·Biphenyl을 "구조가 가까운 화합물과 방향족 탄화수소"용으로 소개합니다.
※ 원문 서론은 E1·E2의 정밀 측정이 임상 연구에서 생식·내분비 기능 평가에 필수적이라고 적습니다. 원문은 "FOR RESEARCH USE ONLY. Not for use in clinical diagnostic procedures."라고 명시합니다 — 이 페이지는 분석법 해설이며 진단 안내가 아닙니다.
실험 조건
시료 전처리 — Strata SE SLE (원문 Table 1)
| 단계 | 원문 조건 |
|---|---|
| 시료 전처리 | 혈청 200 µL (Mass Spec Gold, Cat # 4000 — 호르몬 초저농도 확인 혈청) + 동위원소 표지 내부표준 400 pg/mL 20 µL + 25 mM 아세트산암모늄 완충액 pH 6.9(조정 안 함) 200 µL |
| 로딩 | 전처리 시료 400 µL를 SLE 플레이트에 |
| 흡수 | 진공을 잠깐 건 뒤 용출 전 5분 대기 |
| 용출 1 · 2 | 에틸아세테이트/헥산(9:1) 900 µL, 진공 잠깐 — 2회 |
| 건조 | 45 °C, 약한 질소 기류 |
| 재용해 | 0.5 mM 불화암모늄 수용액/메탄올(60:40, v/v) 200 µL |
※ 원문 주문 정보에는 Strata SE SLE MAX(8E-S542-5GB)와 MINI(8E-S542-FGB) 96웰 플레이트가 실려 있으나, 방법에 어느 형식을 썼는지는 원문에 별도 수록되지 않았습니다. 내부표준의 구체적 화합물명도 원문에 없습니다.
LC 조건 — 컬럼 스크리닝 vs 최적화 방법
| 항목 | 컬럼 스크리닝 (4종 공통) | 최적화 방법 (E1·E2) |
|---|---|---|
| 컬럼 | Luna Omega Polar C18 (00B-4760-Y0) · Kinetex C18 (00B-4462-Y0) · Kinetex F5 (00B-4723-Y0) · Kinetex Biphenyl (00B-4622-Y0)† | Kinetex 2.6 µm Biphenyl‡ |
| 치수 | 50 × 3.0 mm | |
| 이동상 | A: 0.5 mM 불화암모늄 수용액 · B: 메탄올 | |
| 그래디언트 (min, %B) | 0 / 40 → 3.0 / 95 → 3.5 / 95 → 3.51 / 40 → 5.0 / 40 → 6.5 / 40 → 8 / 40 | 0.0 / 40 → 3.0 / 95 → 3.5 / 95 → 3.51 / 40 → 5.0 / 40 |
| 유속 | 0.8 mL/min§ | |
| 주입량 | 5 µL | 20 µL |
| 온도 | 30 °C | |
| LC · 검출기 | Agilent 1290 Infinity · SCIEX 7500 Triple Quad (MS/MS) | |
| MS/MS | ESI, 극성 Positive or Negative(원문 표기) · 소스 700 °C · GS1 60 / GS2 60 / CUR 40 psi · CAD 10 · IS −3000 V · EP −10 V | 스크리닝과 같은 소스 조건(원문) |
† 원문 스크리닝 목록의 Biphenyl 번호는 "00B-4622-Y0O"로 끝에 문자가 하나 더 붙어 있습니다. ‡ 최적화 조건표는 입자 크기를 "2.6 mm"로, 부품 번호를 00B-4462-Y0으로 적는데, 이 번호는 같은 원문 스크리닝 목록에서 Kinetex C18의 번호입니다 — 원문 내부 불일치이므로 주문 전 제조사에 확인하십시오. 입자 크기 단위는 µm의 오기로 보았습니다. § 원문 표기는 "0.8 L/min"이며 mL/min의 오기로 보았습니다.
※ 스크리닝 컬럼 4종의 입자 크기, 스크리닝에 주입한 시료(표준액·추출액 여부), E1·E2와 내부표준의 MRM 전이는 원문에 별도 수록되지 않았습니다.
원문 1쪽의 E1·E2 구조식과 컬럼 4종 결합상 도식, 4쪽의 주문 정보 (플레이트·매니폴드·수집 플레이트·실링 매트 부품 번호)는 원문에서 확인하십시오.
Phenomenex 원문 보기 (TN-1408)결과 ① 컬럼 4종 — E1·E2 간격 한눈에 (원문 Figure 2~5)
같은 이동상·그래디언트·50 × 3.0 mm 치수에서 결합상만 바꿔 E1·E2를 흘린 결과입니다. RT는 원문 그림 속 표시값을 컬럼피아가 읽은 것이고, 간격은 그 차이를 계산한 값입니다.
| 컬럼 | 입자 | 원문 도식 설명 | E1 RT (분) | E2 RT (분) | 간격 (계산) | 먼저 나옴 | 원문 서술 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Luna Omega Polar C18 (Fig. 2) | 완전다공성 | C18 + 극성 개질 표면 | 4.627 | 4.656* | 0.03 | E1 | 공용리(co-eluted) |
| Kinetex C18 (Fig. 3) | 코어셀 | 소수성 화합물(LogP 기반 분리) | 3.869 | 3.995 | 0.126 | E1 | 0.1분 |
| Kinetex F5 (Fig. 4) | 코어셀 | 구조가 가까운 화합물·방향족 | 4.360 | 4.142 | 0.218 | E2 | 0.2분 |
| Kinetex Biphenyl (Fig. 5) | 코어셀 | 구조가 가까운 화합물·방향족 | 5.453 | 4.578 | 0.875 | E2 | 약 1분(almost 1 minute) |
E1·E2 간격 (분, 컬럼피아 계산)
* Luna Omega Polar C18의 E2 표시값은 피크 선과 겹쳐 두 번째 소수 자리가 4.656과 4.666 사이에서 확실하지 않습니다. 어느 쪽이든 간격은 0.03~0.04분으로, 원문은 이를 "공용리"로 적습니다. "입자" 열의 Luna Omega 완전다공성은 원문 도식 표기("Fully porous")이고, Kinetex 코어셀은 제품 성격입니다. 스크리닝 컬럼의 입자 크기는 원문에 없으므로 이 표는 결합상과 입자 구조가 함께 다른 비교로 읽어야 합니다.
Figure 2. Estrogens separation Luna Omega Polar C18
가운데 E1 4.627분, 아래 E2 약 4.66분 — 두 피크가 거의 같은 자리에 있습니다(원문: 공용리). 맨 위 채널은 원문에 이름이 적혀 있지 않습니다.
Figure 5. Estrogens separation Kinetex Biphenyl
E2 4.578분이 먼저, E1 5.453분이 뒤에 나와 간격 0.875분(컬럼피아 계산, 원문: 약 1분). 아래 E2 채널에는 E1 자리(약 5.45분)에 작은 신호가 보입니다(컬럼피아 판독).
※ 가운데 두 컬럼(Kinetex C18 = Figure 3, Kinetex F5 = Figure 4)의 크로마토그램은 위 표에 RT로 옮기고 그림은 원문에 남겨 두었습니다. 위 "간격"은 피크 꼭대기 사이 시간이며, 원문은 분리도(Rs)를 제시하지 않았습니다.
결과 ② 최적화 방법 — 5분 그래디언트 (원문 Figure 1)
Figure 1. Optimized E1 and E2 separation on Kinetex Biphenyl
가운데 E1 3.195분, 아래 E2 2.686분 — 간격 0.509분(컬럼피아 계산). 스크리닝(Figure 5)의 0.875분보다 좁아졌고, 원문은 짧은 주입 간격(5분)에서도 좋은 분리를 유지했다고 적습니다. 맨 위 채널(2.677·3.191분)은 원문에 이름이 적혀 있지 않습니다.
결과 ③ 검량선과 저농도 크로마토그램 (원문 Figure 6·7)
| 성분 | 검량 범위 | 가중 | 회귀식 | R² |
|---|---|---|---|---|
| 에스트론 (E1) | 1~500 pg/mL | 1/x | y = 0.01019x − 0.01249 | 0.99800 |
| 에스트라디올 (E2) | 5~500 pg/mL | 1/x | y = 0.01867x + 0.01624 | 0.993 |
※ 원문 Figure 6 수치를 옮겼습니다(원문 표기 "+ -0.01249"). 그림의 가로축은 "Concentration Ratio", 세로축은 "Area Ratio"입니다. 검량 시료를 어떤 매트릭스로 만들었는지, 각 수준의 정확도는 원문에 별도 수록되지 않았습니다.
Figure 7. Underivatized Estrone and Estradiol at Low Concentrations
유도체화하지 않은 저농도 피크 — E1 5 pg/mL S/N = 12, E2 10 pg/mL S/N = 8, E2 20 pg/mL S/N = 19(원문 그림 표기). 피크 꼭대기 표시는 각각 약 3.21분, 2.734분, 2.696분입니다(컬럼피아 판독). S/N 계산 방식은 원문에 없습니다.
⚠️ 원문 대조 메모
- 원문 본문은 그래디언트를 "최적화해 분석 시간을 줄였다"고 적지만, 두 그래디언트 표는 5.0분까지 같고 스크리닝 표에 40% 유지(6.5·8분)가 더 붙어 있을 뿐입니다. 그런데 Biphenyl에서 E1 RT는 5.453분(Figure 5) → 3.195분(Figure 1)으로 크게 달라, 표만으로는 이 변화가 설명되지 않습니다. 스크리닝 표가 실제 조건과 같은지 원문 저자 측에 확인이 필요합니다.
- 최적화 조건표의 부품 번호 00B-4462-Y0은 스크리닝 목록의 Kinetex C18 번호와 같습니다(Biphenyl은 스크리닝 목록에서 00B-4622-Y0으로 표기). "2.6 mm", "0.8 L/min"은 단위 오기로 보고 µm·mL/min으로 적었습니다.
- 본문은 저농도 그림을 "E1 and E1"이라고 적지만 Figure 7은 E1과 E2입니다. MS/MS 극성은 "Positive or Negative"로 적혀 있고 어느 쪽으로 측정했는지는 명시되지 않았습니다(IS −3000 V 표기).
- E2의 검량 최저점은 5 pg/mL이지만, 저농도 그림의 E2 최저 농도는 10 pg/mL(S/N 8)입니다. 원문은 정량한계(LLOQ)를 따로 정의하지 않았습니다.
- 결론의 "SPE보다 적은 단계로 깨끗한 추출물"은 원문 안에 SPE 비교 데이터가 없는 정성적 서술입니다.
이 페이지에 싣지 않은 Figure 3(Kinetex C18), Figure 4(Kinetex F5) 스크리닝 크로마토그램과 Figure 6(검량선 그림), 결론 옆의 Strata SE SLE 3단계 도식은 원문에서 확인하십시오.
Phenomenex 원문 보기 (TN-1408)데이터 해석 및 실무 제언
E1·E2 분리는 "결합상 고르기" 문제였습니다
같은 코어셀 Kinetex 세 종류 사이에서도 간격이 0.126분(C18) → 0.218분(F5) → 0.875분(Biphenyl)으로 7배 가까이 벌어졌습니다(컬럼피아 계산). 입자 구조가 같은 세 컬럼에서 이만큼 차이가 났으므로, 이 쌍에서는 입자 구조보다 결합상 선택이 분리를 좌우했다고 읽는 편이 자연스럽습니다. 반대로 "완전다공성이라 공용리, 코어셀이라 분리"로 읽으면 안 됩니다 — Luna Omega Polar C18은 결합상도 다르고, 입자 크기는 원문에 없습니다.
MS/MS가 있어도 분리가 필요한 이유 — 교차 신호를 점검하세요
Biphenyl 스크리닝(Figure 5)의 E2 채널에는 E1이 나오는 자리(약 5.45분)에 작은 신호가 보입니다(컬럼피아 판독). 원문은 MRM 전이를 싣지 않아 원인을 확정할 수 없지만, E1과 E2처럼 골격이 같은 쌍에서는 한 성분이 다른 성분의 채널에 신호를 남기는지 흔히 점검합니다. 두 성분이 공용리하면(Luna Omega Polar C18처럼) 이런 신호가 E2 피크와 겹쳐 구분할 수 없게 됩니다. 도입 시 E1 단독 고농도 표준을 주입해 E2 채널을 확인해 두십시오.
용출 순서가 바뀌는 점을 방법 이전 때 챙기세요
그림 표시 RT로 보면 Luna Omega Polar C18·Kinetex C18에서는 E1이 먼저, Kinetex F5·Biphenyl에서는 E2가 먼저 나옵니다. 기존 C18 방법에서 Biphenyl로 옮기면 피크 순서가 뒤집히므로, 처리 방법(RT 창·피크 이름 지정)을 새로 잡아야 합니다. 원문은 순서가 바뀌는 이유를 해설하지 않습니다.
감도가 모자라면 — 원문이 든 네 가지 전략
원문 결론은 더 높은 감도를 얻는 전략으로 혈청 사용량 늘리기, 재용해 부피 줄이기, 주입량 늘리기, 유도체화를 듭니다. 이 방법은 전처리액 420 µL 중 400 µL(혈청 약 190 µL분)를 로딩해 200 µL로 재용해하므로 농축 배율이 약 0.95배이고, 주입량은 20 µL입니다(컬럼피아 계산). 처음 세 가지는 이 숫자를 바꾸는 쪽인데, 부피를 바꾸면 SLE 플레이트 용량·용출량·매트릭스 부하가 함께 바뀌므로 재검증 대상입니다. 원문은 이 전략들을 실험으로 보여 주지는 않았습니다.
이 자료가 말하지 않는 것
회수율, 매트릭스 효과, 일내·일간 정밀도, 정확도, 실제 시료 결과, 정량한계 정의는 원문에 없습니다. 결과는 한 LC·한 질량분석기(SCIEX 7500) 조합의 것이며, 다른 기종에서 같은 감도가 나온다는 근거는 원문에 없습니다. 원문 결론은 인용 문헌(각주 1)의 집단 농도 분포를 들어 이 방법이 "임상 연구용 시료 대다수"를 다룰 수 있다고 적지만, 그 문헌 목록은 원문 PDF에 수록되지 않았고 이 페이지는 해당 분포를 참고치로 옮기지 않습니다.
같은 Strata SE SLE 혈청 자료와 무엇이 다른가
| 항목 | 이 페이지 (TN-1408) | 알도스테론 (TN-0155) | 메틸말론산 (TN-1409) |
|---|---|---|---|
| 분석 대상 | 에스트론·에스트라디올 | 알도스테론(혈청·소변) | 메틸말론산(혈청) |
| 원문이 비교한 것 | 분석 컬럼 4종 | SLE 제품 4종 + 기존 SPE | 컬럼 3종·분리 모드 · 용출 용매 |
| 혈청 · 용출 | 200 µL · 에틸아세테이트/헥산(9:1) 900 µL × 2 | 350 µL · 에틸아세테이트 500 µL × 2 | 에틸아세테이트/헥산(9:1) 900 µL × 2 |
| 분석 컬럼 | Kinetex 2.6 µm Biphenyl 50 × 3.0 mm | Kinetex 2.6 µm Biphenyl 50 × 3.0 mm | Luna Omega 3 µm PS C18 (HILIC 조건) |
| 핵심 질문 | 유도체화 없이 pg/mL 수준 E1·E2를 분리·정량 | SLE 제품·방법 간 정밀도와 일치도 | 동중체(숙신산) 분리 |
※ 세 자료는 분석 대상·시료량·검출 조건이 달라 수치를 서로 직접 비교할 수 없습니다. 전처리 흐름과 컬럼 선택의 참고로만 쓰십시오.
결정 가이드 — 우리 랩의 에스트로겐 분석에 적용해 볼까?
TN-1408의 조건과 결과를 기준으로 한 컬럼피아의 판단 틀입니다. 연구용(RUO) 분석법 기준이며, 어느 경우든 자체 밸리데이션이 먼저입니다.
| 우리 랩 상황 | 판단 | 근거 |
|---|---|---|
| C18 계열 컬럼에서 E1·E2가 붙어 나오거나 간격이 좁음 | 결합상 교체 우선 검토 | 같은 스크리닝 조건에서 간격 C18 0.126분 · Biphenyl 0.875분(컬럼피아 계산) |
| 유도체화 단계를 쓰고 있고, 대상 농도가 원문 검량 범위(E1 1~500, E2 5~500 pg/mL) 안 | 병행 비교 가치 있음 | 유도체화 없이 해당 범위 검량 R² 0.998·0.993 보고 — 회수율·정밀도는 자체 확인 필요 |
| E2를 10 pg/mL 아래에서 정밀하게 정량해야 함 | 원문만으로는 근거 부족 | E2 10 pg/mL S/N 8, LLOQ 미정의 — 원문이 든 감도 전략(시료량·재용해·주입량·유도체화) 검토 |
| 원문과 다른 질량분석기를 사용 | 감도 재확인 필수 | 원문 결과는 SCIEX 7500 한 기종의 것 |
| 임상 진단 목적의 검사 | 해당 없음 | 원문: FOR RESEARCH USE ONLY. Not for use in clinical diagnostic procedures. |
참고 자료 및 원문
TN-1408: Derivatization-Free LC–MS/MS Analysis of Estrogens with Streamlined Sample Cleanup
Stephanie J. Marin, PhD, Rajashree Chakravarti, PhD (Phenomenex, Inc., Torrance, CA)
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