Semaglutide 정량 및 불순물 분리 최적화
Aeris™ Peptide XB-C18으로 8종 Known + 3종 Unknown 불순물 완전 분리
TN-1386 · Phenomenex Technical Note
30초 요약
Assay + RS 2-in-1
Assay(45분)와 Related Substances(85분) 두 메소드를 Aeris Peptide XB-C18 단일 컬럼으로 개발
11종 불순물 분리
8종 known impurity + 3종 unknown impurity 모두 Semaglutide로부터 분리, Resolution ≥ 1.3
탁월한 재현성
6회 반복 주입 RT %RSD ≤ 0.1%, Area %RSD ≤ 4.1% — 시스템 적합성 확보
공식 데이터 vs 컬럼피아 실무 인사이트
제조사 공식 Spec
- Aeris Peptide XB-C18, 2.6 µm, 150 × 4.6 mm (00F-4505-E0)
- Buffer: 100 mM Ammonium dihydrogen phosphate + 0.07% Perchloric acid
- 온도 25 °C, 검출 210 nm, Waters Arc HPLC
- Assay %RSD: RT 0.0%, Area 0.1% (N=6)
컬럼피아 실무 인사이트
- XB-C18의 di-isobutyl 측쇄 → 넓은 리간드 간격으로 20+ 잔기 펩타이드의 효과적인 상호작용
- Core-shell 입자 → 확산 최소화로 좁은 피크폭, D-아미노산 이성체 분리에 결정적
- Semaglutide 불순물 분석법 최초 보고서 → 업계 분석법 개발 레퍼런스
- 0.2~2% 4단계 spike에서 Resolution 일관 유지 → Robustness 검증 완료
🛋️ The Interpreter: 기술 용어 쉽게 풀기
🧬 D-아미노산 이성체란?
아미노산에는 L-형과 D-형이 있습니다. 자연의 단백질은 L-형만 사용하지만, 합성 펩타이드에서는 D-형이 불순물로 혼입될 수 있습니다. 마치 왼손 장갑과 오른손 장갑처럼 화학적 성질은 거의 같지만 구조가 거울상이라, 일반 C18 컬럼으론 분리가 매우 어렵습니다. XB-C18의 넓은 리간드 간격이 이 미세한 차이를 구분합니다.
🔬 Assay vs Related Substances의 차이
Assay는 주성분(Semaglutide)의 정확한 함량을 측정하는 것이 목적이며, 빠른 분석(45분)이 가능합니다. Related Substances는 모든 불순물을 하나하나 분리·정량하는 것이 목적이며, 더 긴 gradient(85분)가 필요합니다. 두 방법 모두 동일한 컬럼으로 수행할 수 있어 효율적입니다.
실험 조건 및 데이터
LC 분석 조건 비교 (Assay vs Related Substances)
| 파라미터 | Assay | Related Substances |
|---|---|---|
| Column | Aeris Peptide XB-C18, 2.6 µm, 150 × 4.6 mm (00F-4505-E0) | |
| Buffer | 100 mM Ammonium dihydrogen phosphate | |
| Mobile Phase A | Buffer:ACN (900:100) + 1 mL 70% Perchloric acid | |
| Mobile Phase B | ACN:MeOH:Water (600:300:100) + 1 mL 70% Perchloric acid | |
| Flow Rate | 0.8 mL/min | 0.6 mL/min |
| Run Time | 45 min | 85 min |
| Temperature | 25 °C | |
| Detection | UV @ 210 nm | |
| LC System | Waters Arc HPLC with PDA | |
Related Substances 분석 결과 (1% Spike)
| No. | Analyte | RT (min) | % Area | USP Res. | USP Tailing |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | Des side chain Semaglutide | 18.479 | 1.56 | — | 1.8 |
| 2 | (3-31) Linear Semaglutide | 19.602 | 0.98 | 2.7 | 1.0 |
| 3 | Unknown impurity 1 | 23.607 | 0.07 | 11.7 | 0.7 |
| 4 | D-Ser (11) Semaglutide | 49.335 | 0.73 | 47.2 | 1.1 |
| 5 | D-Ser (8) Semaglutide | 52.087 | 0.73 | 3.4 | 1.0 |
| 6 | D-Asp (9) Semaglutide | 53.987 | 0.53 | 2.3 | 1.1 |
| 7 | Unknown impurity 2 | 55.588 | 0.29 | 1.8 | 1.0 |
| 8 | Unknown impurity 3 | 57.722 | 0.35 | 2.0 | 0.8 |
| 9 | D-Phe (6) Semaglutide | 59.037 | 0.62 | 1.4 | 0.9 |
| 10 | Semaglutide | 60.203 | 92.92 | 1.1 | 2.2 |
| 11 | D-His (1) Semaglutide | 65.271 | 0.62 | 4.4 | 0.8 |
| 12 | (3-31) Semaglutide | 67.280 | 0.60 | 2.4 | 0.9 |
Spike 농도별 Resolution 비교
| Analyte | RT | 0.2% | 0.5% | 1% | 2% |
|---|---|---|---|---|---|
| Des side chain | 18.5 | — | |||
| (3-31) Linear | 19.6 | 2.7 | 2.7 | 2.7 | 2.8 |
| D-Ser (8) | 52.1 | 3.4 | 3.3 | 3.4 | 3.5 |
| D-Phe (6) | 59.0 | 1.6 | 1.4 | 1.4 | 1.3 |
| Semaglutide | 60.0 | 1.0 | 1.0 | 1.1 | 1.0 |
| D-His (1) | 65.2 | 4.6 | 4.3 | 4.4 | 4.3 |
* 모든 불순물에서 0.2~2% spike 범위 전체에 걸쳐 Resolution ≥ 1.3 유지
Figure 2. Chromatogram of Semaglutide standard spiked with known impurities at 0.5 % level on Aeris Peptide XB-C18, 2.6 µm 150 x 4.6 mm.
Assay 조건에서 8종 known impurity와 3종 unknown impurity가 Semaglutide(29.7분)로부터 모두 분리됩니다. 45분 gradient로도 충분한 선택성을 제공합니다.
Figure 4. Overlayed chromatogram of blank and Semaglutide standard spiked with known impurities at 1.0 % level on Aeris Peptide XB-C18, 2.6 µm 150 x 4.6 mm.
85분 gradient로 최적화된 RS 방법. 12개 피크 모두 Resolution ≥ 1.3으로 분리됩니다. Des side chain과 (3-31) Linear는 초기 용출, D-아미노산 이성체들은 Semaglutide 주피크 전후에 분포합니다.
Figure 7. Overlayed chromatograms of Semaglutide standard spiked with known impurities at 0.2 %, 0.5%, 1 % and 2 % levels on Aeris™ Peptide XB-C18.
불순물 농도 0.2~2% 범위에서 모든 피크의 Resolution이 일관되게 유지됩니다. 이는 메소드의 Robustness를 입증하며, 실제 배치 간 불순물 농도 변동에도 신뢰할 수 있는 결과를 보장합니다.
데이터 해석 및 실무 제언
XB-C18의 핵심 선택성
Aeris Peptide XB-C18은 di-isobutyl 측쇄를 가진 C18 리간드를 사용합니다. 일반 직선형 C18 대비 리간드 간 간격이 넓어, 30+ 잔기의 긴 펩타이드가 고정상과 효과적으로 상호작용할 수 있습니다. 이는 Semaglutide(31 잔기)의 D-아미노산 이성체처럼 구조적으로 극히 유사한 불순물 분리에 결정적인 역할을 합니다.
Perchloric Acid 기반 이동상의 장점
이 방법은 TFA 대신 Perchloric acid를 이온 페어 시약으로 사용합니다. Perchloric acid는 TFA 대비 UV 커트오프가 낮아(~200 nm) 210 nm 검출에서 배경 흡수 간섭이 적고, 높은 이온 강도로 재현성 있는 이온 페어 효과를 제공합니다.
전문가 제언
01. Semaglutide 불순물 분석의 업계 최초 레퍼런스
이 Technical Note는 Semaglutide의 8종 known impurity를 체계적으로 분리·정량한 최초의 공개 보고서입니다. GLP-1 RA 분야에서 분석법을 개발하는 실무자에게 기초 레퍼런스로써 활용 가치가 높습니다.
02. Assay와 RS 방법을 별도로 운영하세요
Assay(45분)는 일상 QC 검사에, RS(85분)는 불순물 프로파일이 필요한 안정성 시험이나 배치 방출에 사용하세요. 동일 컬럼 + 동일 이동상에서 gradient만 달리하므로 전환이 간편합니다.
03. D-Phe (6)과 Semaglutide 간 Resolution 모니터링
가장 critical한 분리는 D-Phe(6) Semaglutide(59.0분)와 Semaglutide(60.0분) 사이입니다 (Resolution 1.3~1.6). 이 쌍의 resolution을 시스템 적합성 기준으로 설정하면 메소드의 건강 상태를 효과적으로 모니터링할 수 있습니다.
참고 자료 및 원문
TN-1386: Optimized HPLC Method for Assay and Separation of Semaglutide from its Known Impurities/Related Substances using Aeris™ Peptide XB-C18
Arunkumar D N, Rajesh Babu Dandamudi, PhD, Sean Orlowicz — Phenomenex, Inc.
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