sgRNA and Cas9 mRNA Characterization by Ion Pairing-Reversed Phase Liquid Chromatography (IP-RP) Coupled to High Resolution Mass Spectrometry.PDF

분야: 바이오제약

소개

이 문서는 sgRNA와 Cas9 mRNA의 특성을 분석하는 성공적인 워크플로우를 제시합니다. BRCA1 유전자 및 CRISPR 관련 단백질 9(Cas9) mRNA를 모델 시스템으로 사용하여, RNase 4 효소적 소화와 이온 쌍 형성 역상 액체 크로마토그래피(IP-RP) 결합 고분리능 질량 분석(HRMS)을 통해 RNA 맵핑을 수행했습니다. 또한 bioZen WidePore C4 HPLC 컬럼을 사용하여 sgRNA의 완전한 형태를 분석하였습니다.

실험 조건 (Experimental Conditions)

• 컬럼:

  • Digested sgRNA 및 mRNA: bioZen 2.6 µm Oligo C18 150 x 2.1 mm
  • Intact sgRNA: bioZen 2.6 µm WidePore C4 150 x 2.1 mm (00F-4786-AN)

• 이동상:

  • Digested sgRNA 및 mRNA: A) 100 mM Hexafluoroisopropanol(HFIP), 6 mM N,N-Diisopropylethylamine(DIPEA) in Water
  • Intact sgRNA:
    • A: 100 mM HFIP, 6 mM DIPEA in Water
    • B: 7 mM HFIP, 0.5 mM DIPEA in Acetonitrile / Water (70:30, v/v)

• 유속: 미제공

• 주입량: 미제공

• 컬럼도: 미제공

핵심 기술 요소

1. sgRNA의 전체 시퀀스 식별 및 염기 순서 오류와 포스포로테이오에이트(PS) 이성질체 분리.
2. Cas9 mRNA의 전체 시퀀스 식별, 5'-UTR / 3'-UTR 영역에서의 삭제 및 수정 확인, 5'캡 정체성 확인 및 부분적으로 캡핑된 종류와 Poly-A 다양성을 포함한 특성화.

응용 분야

1. sgRNA 및 mRNA의 고해상도 질량 분석을 위한 'one-method-fits-all' 접근법.
2. BRCA1 유전자 표적화를 위한 sgRNA의 특성화.

결론 및 권장사항

본 연구는 bioZen Oligo C18와 bioZen Widepore C4 컬럼을 사용하여 IP-RP LC-MS 분석으로 sgRNA와 mRNA의 특성을 성공적으로 확인하였습니다. 특히, PS 이성질체의 우수한 분리능과 5'캡 및 Poly-A 꼬리의 고도로 다양한 종류를 포함한 Cas9 mRNA의 정확한 시퀀스 커버리지를 달성했습니다. 향후에는 T4 폴리뉴클레오타이드 카인아제 사용, 5'캡 및 3'Poly-A 꼬리 농축화 등으로 더 깊은 특성화를 수행할 수 있습니다.

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