Utilizing Biphasic Salt and pH Gradients for Charge Variant Analysis (TN-1252).PDF

분야: 바이오제약

소개

이 문서는 이온교환 크로마토그래피(CEX)를 이용한 단일클론항체(mAbs)의 전하 변이 분석 방법을 다룹니다. 특히, 간단한 염 농도 경사와 pH 경사를 사용하는 두 가지 접근법에 대해 설명하며, 이들 방법 중 하나인 양성자 교환 크로마토그래피에서의 이온 강도 및 pH 변화를 이용한 분석 기술을 소개합니다.

실험 조건 (Experimental Conditions)

• 컬럼: bioZen 6µm WCX
• 차원: 250 x 4.6 mm
• 부품 번호: 00G-4777-E0
• 이동상:
  • Method 1:
    • 20 mM MES, pH 5.6
    • 20 mM HEPES + 150 mM NaCl, pH 8.0
  • Method 2:
    • A: CX-1 Gradient Buffer A, pH 5.6
    • B: CX-1 Gradient Buffer B, pH 10.2
• 경사: 0-100 % B in 30 minutes
• 유속: 30 °C
• 검출기 설정: UV @ 280 nm

핵심 기술 요소

• 염 농도 경사를 사용한 CEX 방법은 비선형 응답을 보이므로, 적절하게 최적화하기 위해 많은 실험 개발이 필요합니다.
• pH 경사 방법은 이온 강도와 pH를 조정하여 단일클론항체의 전하 변이 분석에 사용되며, 특히 '플랫폼 메소드'로 쉽게 구현할 수 있습니다.
• MES 및 HEPES Good's 버퍼와 NaCl을 이용한 양상 경사 방법은 다양한 mAbs를 효과적으로 분리합니다.

응용 분야

• Trastuzumab의 경우, CX-1 gradient buffers에 비해 biphasic mobile phases가 약간 더 나은 분리능과 높은 피크 높이를 제공합니다.
• 다양한 mAbs에서 양성자 교환 크로마토그래피를 이용한 전하 변이 분석 방법의 적용.

결론 및 권장사항

염 경사와 pH 경사를 사용하는 두 가지 접근법을 비교하였으며, biphasic mobile phases는 CX-1 gradient buffers에 비해 약간 더 나은 분리능과 높은 피크 높이를 제공합니다. 이 방법은 전통적인 염 경사보다 많은 실험 개발 없이 유사한 분리를 제공할 수 있습니다.

참고 문헌

• Fekete, S.; Beck, A.; Fekete, J.; Guillarme, D. Method development for the separation of monoclonal antibody charge variants in cation exchange chromatography, Part I: salt gradient approach. J. Pharm. Biomed. Anal. 2014, 102C, 33-44.
• Shen H., Li X., Bieberich C.J., Frey D.D. Reducing Sample Complexity in Proteomics by Chromatofocusing with Simple Buffer Mixtures. In: Posch A. (eds) 2D PAGE: Sample Preparation and Fractionation. Methods in Molecular Biology ™ Humana Press, 2008; Vol. 424; p. 187-203.
• Farnan, D.; Moreno, G. T. Multiproduct High-분리능 Monoclonal Antibody Charge Variant Separations by pH Gradient Ion-Exchange Chromatography Anal. Chem. 2009, 81(21), 8846-8857.
• Patel, B. A., et al. On-Line Ion Exchange Liquid Chromatography as a Process Analytical Technology for Monoclonal Antibody Characterization in Continuous Bioprocessing Anal. Chem., 2017, 89(21), 11357-11365.

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